Игра продолжается вскоре после событий Assassin’s Creed, где, в 2012 году, Дезмонду Майлсу — пленнику «Абстерго Индастриз», которого используют для дешифрования его генетической памяти о его предке-ассасине Альтаире в машине «Анимус», — грозит смертельная опасность. «Абстерго», современный эквивалент рыцарей-тамплиеров, использовали Дезмонда, чтобы определить местонахождение мощного артефакта, именуемого «Частицей Эдема», или «Яблоком».
После погружения в «Анимус» действие игры начинает разворачиваться в Италии, в Эпоху Возрождения, конец XV века. Главным героем игры становится семнадцатилетний юноша по имени Эцио. Отца Эцио, Джованни Аудиторе, предал его лучший друг Уберто Альберти, и в результате обвинения, отец и братья Эцио были повешены. Для Эцио потеря семьи была сильной душевной травмой. Он убивает предателя своей семьи и скрывается вместе с матерью и сестрой у своего дяди Марио на вилле Аудиторе в Монтериджони.
